Rastreo de linaje para el estudio y la manipulación de poblaciones celulares heterogéneas

Aquí describimos el método de control de linajes mediante transcripción recombinante con código de barras (COLBERT), en el que se utilizan códigos de barras de ARN guía único (sgRNA) como etiquetas funcionales para identificar y recuperar linajes específicos de interés.
Un código de barras sgRNA se integra de forma estable y se transcribe activamente, de manera que toda la progenie celular contendrá el código de barras parental y producirá un sgRNA funcional. El código de barras del sgRNA tiene todas las ventajas de un código de barras de ADN y funcionalidades añadidas. Una vez que se identifica un código de barras perteneciente a un linaje de interés, el linaje de interés puede aislarse utilizando una variante activadora de Cas9 (como dCas9-VPR) y una secuencia coincidente con el código de barras aguas arriba de un gen reportero fluorescente. La activación CRISPR del reportero fluorescente sólo se producirá en las células que produzcan el código de barras sgRNA coincidente, lo que permite una identificación y un aislamiento precisos de los linajes de interés a partir de poblaciones heterogéneas.

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Mejora del rendimiento, la estabilidad y la reacción de escisión de un nuevo mutante de la proteasa del virus del grabado del tabaco

La subunidad catalítica de la proteína de inclusión nuclear A del virus del aguafuerte del tabaco (TEVp) se utiliza ampliamente para eliminar etiquetas y proteínas de fusión de las proteínas recombinantes. Durante muchos años se han estudiado algunos inconvenientes intrínsecos a su producción recombinante www.joplink.net/tag-recombinants, como la baja solubilidad, la autoproteólisis y la inestabilidad. Se han incorporado algunas mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de la proteasa para mejorar su producción. Aquí se ha hecho una revisión exhaustiva de cada una de las mutaciones reportadas hasta ahora para incorporarlas en un mutante llamado TEVp7M con un total de siete cambios.

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Este mutante con un His7tag en el N-terminal fue producido con notables rendimientos de purificación (55 mg/L de cultivo) a partir de la fracción soluble en un solo paso de purificación por afinidad. Se analizó la estabilidad de His7-TEVp7M y se comparó con el mutante único TEVp S219V, poniendo de manifiesto que His7-TEVp7M muestra una estabilidad térmica muy constante frente a la variación del pH, mientras que TEVp S219V es muy sensible a este cambio. La reacción de escisión se optimizó determinando la cantidad de proteasa que podía escindir un sustrato 100 veces superior en el menor tiempo posible a 30 °C. En estas condiciones, His7-TEVp7M fue capaz de escindir el His-tag en los tampones comúnmente utilizados para la purificación por afinidad.
Por último, un análisis estructural de las mutaciones mostró que cuatro de ellas aumentaban la polaridad de los residuos implicados y, en consecuencia, mostraban una mayor solubilidad de la TEVp y menos regiones hidrofóbicas expuestas al disolvente. En conjunto, los siete cambios estudiados en este trabajo mejoraron la estabilidad, la solubilidad y la actividad de la TEVp produciendo suficiente proteasa para digerir grandes cantidades de etiquetas o proteínas de fusión. PUNTOS CLAVE: – Producción de excelentes rendimientos de una TEVp (TEVp7M) mediante la incorporación de siete cambios. – Eliminación de la etiqueta His en un exceso de sustrato en los tampones comunes utilizados para la purificación. – Las mutaciones incorporadas mejoran la polaridad, la estabilidad y la actividad de la TEVp7M.

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La introducción de una etiqueta de hexalisina (6 K) puede proteger de la escisión del extremo N y aumentar el rendimiento de las proteínas recombinantes expresadas en el periplasma de E. coli

La expresión recombinante de proteínas en el periplasma de E. coli se utiliza con frecuencia para proteínas que contienen enlaces disulfuro que son esenciales para el plegamiento y la actividad de las proteínas, ya que el citosol de E. coli constituye un entorno reductor. El periplasma, en cambio, es un entorno oxidativo que favorece el correcto plegamiento de las proteínas. Sin embargo, el rendimiento puede ser limitado en comparación con la expresión citoplasmática, y los protocolos deben ajustarse para evitar la sobrecarga de la maquinaria de transporte periplásmica.
Otro problema menos apreciado de la expresión periplásmica es la posible generación de productos de escisión N-terminal no deseados, un problema persistente que encontramos al expresar las regiones extracelulares que contienen enlaces disulfuro de varias adhesinas de Helicobacter pylori (BabA, BabB, BabC y LabA) en el periplasma de E. coli XL10 GOLD, una cepa tradicionalmente no utilizada para la expresión de proteínas.
Aquí describimos cómo la introducción de una etiqueta C-terminal de hexa-lisina (6 K) mejoró la solubilidad y protegió a BabA de la degradación proteolítica N-terminal (BabA), permitiendo la cristalización y el posterior análisis estructural por rayos X. Sin embargo, la misma estrategia no tuvo ningún efecto ventajoso para LabA, que utilizando este protocolo pudo recuperarse del periplasma en rendimientos relativamente altos (20-40 mg/L).

La proteína 5 tipo romboide de Eimeria maxima proporcionó una protección parcial contra el desafío homólogo en formas de proteína recombinante y plásmido de ADN en pollos
Eimeria maxima (E. maxima) es una de las especies más prevalentes que causan coccidiosis en las granjas de pollos. Durante la invasión de protozoos apicomplejos, las proteínas de tipo romboide (ROMs) escinden las proteínas de micronema (MICs), permitiendo que los parásitos entren completamente en las células del huésped, lo que sugiere que las ROMs tienen el potencial de ser antígenos candidatos para el desarrollo de vacunas de subunidad o de ADN contra la coccidiosis. En este estudio, se expresó y purificó una proteína recombinante de E. maxima ROM5 (rEmROM5) y se utilizó como vacuna de subunidad. Se construyó el plásmido de expresión eucariota de pVAX-EmROM5 y se utilizó como vacuna de ADN. Los pollos de dos semanas de edad fueron vacunados con las vacunas rEmROM5 y pVAX-EmROM5 dos veces, con un intervalo de una semana entre los períodos de vacunación. La transcripción y expresión de pVAX-EmROM5 en los lugares inyectados se detectó mediante ensayos de PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y Western blot (WB).

Las respuestas inmunitarias celular y humoral inducidas por EmROM5 se determinaron mediante la detección de la proporción de linfocitos T CD4+ y CD8+, los niveles de citoquinas y los niveles de anticuerpos en suero. Por último, se realizaron ensayos de vacunación-desafío para evaluar la eficacia protectora de EmROM5 en formas de la proteína recombinante (rEmROM5) y en el plásmido de ADN (pVAX-EmROM5) por separado. Los resultados mostraron que la rEmROM5 tenía unos 53,64 kDa, que fue bien purificada y reconocida por el anticuerpo monoclonal de ratón His-Tag y el suero de pollo contra E. maxima por separado.
Tras la vacunación, el pVAX-EmROM5 se transcribió y expresó con éxito en los sitios inyectados de los pollos. La vacunación con rEmROM5 o pVAX-EmROM5 promovió significativamente la proporción de linfocitos T CD4+/CD3+ y CD8+/CD3+, los niveles de ARNm de las citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-17, TNF SF15 e IL-10, y los niveles de anticuerpos IgG específicos en comparación con los grupos de control. La inmunización también redujo significativamente la pérdida de peso, la producción de ooquistes y las lesiones intestinales que provoca la infección por E. maxima.

Protein A protein
Fitzgerald
Protein A Protein
Abbexa
pLDH Protein Protein
Abbexa

El índice anticoccidial (IAC) de los grupos vacunados fue superior a 160, lo que demuestra una protección moderada contra la infección por E. maxima. En resumen, EmROM5 fue capaz de inducir una respuesta inmunitaria robusta y una protección eficaz contra E. maxima en pollos, tanto en forma de proteína recombinante como de plásmido de ADN. Por consiguiente, EmROM5 podría utilizarse como antígeno candidato para vacunas de ADN y vacunas de subunidades contra la coccidiosis aviar.

Un nuevo enfoque para la producción de proteínas propensas a la agregación utilizando la etiqueta NT* derivada de la espidroína
Las arañas han desarrollado proteínas que pueden mantenerse en una forma soluble altamente concentrada en la glándula de la seda y, sin embargo, ensamblarse rápidamente en fibras de seda estables bajo ciertas condiciones ambientales.

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Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
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MagSi-WAX
AMSBIO
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